電影劇情改編了原作的偽冒拔刀齋騷動事件及觀柳宅邸闖入事件。
時為幕府末年，本名緋村劍心的倒幕方名劍客千人斬拔刀齋在動盪時期以「飛天御劍流」稱霸暗殺界。
1868年京都鳥羽伏見山中，支持新政府的倒幕派薩長軍與幕府軍展開激戰，處於下風的幕府軍好不容易得到了齋藤一率領的新選組支援，不料拔刀齋卻現身立斬十幾人，將形勢壓了回去，齋藤正欲與他決戰，薩長軍便帶來天皇的御旗當眾宣布幕府軍為反賊。劍心知道自己夢寐以求的新時代已經來臨，正待離開戰場時，不甘心的齋藤向他叫囂事情並未結束，即使時代變遷武士也只有以劍生存之道，但劍心聽罷只是將刀插在地上揚長而去。然而戰鬥平息後，倖存的幕府殺手鵜堂刃衛從屍堆中站起，並找到了劍心所棄之刀。
場景來到十年後的東京，黑心實業家武田觀柳靠著財力雇用了許多失業的武士與浪人，野心勃勃的他要脅女醫師高荷惠製造新型鴉片「蜘蛛網」，打算以此賺錢，轉手購買武器割據一方。又讓手下的殺手外印、戌亥番神等人滅了其他知道配方的醫生，其中一人正是警方的臥底，他在逃出觀柳宅邸時，被假冒神谷活心流拔刀齋名義的刃衛殺死。成為警察並更名藤田五郎的齋藤負責偵辦此事，看到手下的屍體便知道事有蹊蹺。而真正的拔刀齋劍心如今立下不殺之誓言，隱然於世流浪各地，不巧也來到東京，正在布告欄上看拔刀齋的通緝令時，神谷活心流代理師傅神谷薫以為他是殺手，持著木刀砍來，劍心急忙拿出了自己的佩刀「逆刃刀」，此刀刀鋒朝內、刀背朝外不可能殺人，小薰見狀道歉，但還是決心找出汙衊自家道場的兇手。
齋藤前往觀柳的宅邸問話，雖然料到殺人事件與他有關，但齋藤苦無證據根本拿他沒辦法，齋藤走後觀柳便聽聞小惠竟然逃跑了，一氣之下便命刃衛前去追擊。沒多久刃衛便找到了小惠藏身的警署，擅長催眠術「心之一方」的他將警察們殺的片甲不留，逼得小惠跳窗逃脫。小薰走在路上不巧遇到了刃衛，領悟此人便是真兇的她立即攻了過去，但完全不是對手，最後劍心及時趕到才化險為夷，並趁著刃衛被警察發現時雙雙逃脫。劍心跟著小薰來到道場，得知神谷活心流提倡不殺的「活人劍」，但門派在父親去世後無以為繼，學徒也僅剩明神彌彥一人。
隔日一早，一群地痞流氓趁著道場剛開來砸場，不僅以神谷活心流出了殺人犯為由要求小薰讓出道場。還嘲笑著她的「活人劍」理想，小薰正準備拼命，察覺動靜的劍心走進道場，不拔刀便狠狠教訓了他們，但隨後趕到的警方以違反廢刀令為由將他連同流氓一起逮捕。齋藤聽說劍心被捕，立刻將他提出監牢，帶去與陸軍大將山縣有朋會面，談話中山縣向劍心解釋了毒品「蜘蛛網」的案件，又表示有意請他加入陸軍，但齋藤從劍心的逆刃刀察覺他放棄殺手的身分後大為不滿，當場拔刀攻擊並斥責這種刀根本保護不了人，最終山縣阻止兩人相鬥，也放走了劍心，感激他的小薰不念他曾是拔刀齋的身分，將劍心帶回家中暫住，還把父親遺留的紅衣借給劍心替換。
與此同時，逃出警署的小惠也被彌彥收留。四人碰面後一同來到火鍋店吃飯，不巧撞見了觀柳，小惠急忙躲進廁所。觀柳聽說劍心的事蹟後也想僱用他，劍心同樣拒絕後，早在監獄中便看到劍心的前赤報隊隊員相樂左之助，向觀柳毛遂自薦，為了證明自己的實力拔出斬馬刀挑戰劍心，但劍心僅僅說了為觀柳賣命並不值得便讓眾人不歡而散。
刃衛趁夜出手將之前砸神谷道場的流氓全數殺害，這次事件讓齋藤對劍心偏見更加深刻。而劍心看到痛哭的死者家屬，也想起他過去受到維新志士大老桂小五郎賞識，為了和平四處暗殺幕府要員，然而某次任務完成後，他卻目睹被殺武士的未婚妻在屍體旁哀痛欲絕的場面，不禁讓他懷疑自己的行徑是否正確，而武士夫妻所留下的十字傷疤也時刻提醒他黑暗的過往。
不久之後，小惠被外印當面警告，隨即便有大批病倒的鄰居湧入道場，原來井水已被觀柳的手下投毒了，由於附近醫生早已失蹤，小惠只好指揮大家解毒，但也因此暴露自己的身分。隨後小惠也向劍心坦承，高荷家原是杏林世家，但家族男丁卻被軍隊徵召全部戰死沙場，為了活下去她不得以成為觀柳的小妾，但自己為救人的醫術卻反被利用來製造鴉片禍害人民，無法承受良心譴責的她最終決定逃跑。
當晚，小惠在道場留下書信，打算犧牲自己，刺殺觀柳以保全朋友，但沒有成功。劍心與朋友被毒害的左之助見到信後，決定私下解決觀柳，兩人殺到宅邸與大批浪人對決，觀柳見狀撒下大筆金錢鼓舞手下，他們仍然不敵劍心高超的劍技與左之助的怪力。宅邸內外印、戌亥番神分別與劍心、左之助對決，結果也接連落敗。觀柳只好拿出自己購買的加特林機關槍打算逼退兩人，但此時齋藤收到彌彥的報信前來，三人利用機關槍難以同時對付兩側的弱點，假降偷襲逮捕了他。
然而兩人找到小惠時，卻聽說刃衛已經問出劍心與小薰兩人的關係，前往道場將小薰綁到了一間破廟，藉此要脅劍心與自己對決。劍心趕到現場，但刃衛高超的劍術加上自身的不殺之誓卻令自己屈居下風，沒多久便身中多刀，刃衛深知劍心還未回復成當初的拔刀齋，便對小薰下了強烈的心之一方，令她肺部麻痺無法呼吸，得知只有殺死施術者別無他法的劍心，為了小薰拋棄誓言，以拔刀術招式雙龍閃擊碎了刃衛的右手腕，並調轉刀刃打算殺死他，然而小薰竟自行解除心之一方，及時叫停了劍心。感到屈辱的刃衛引刀切腹，嘲諷自己會在地獄裡看著劍心能裝作偽善的嘴臉到何時，隨後斷氣倒下。與警察前來善後的齋藤看到抱著小薰離開的劍心，重申了自己當初在鳥羽伏見的宣言。故事也在左之助、小惠留在道場寄居，醒來的小薰找到了決定不再離開的劍心後結束。